用于高通量三维流体动力聚焦的快速制造且经济实惠的单层微流控装置

微流控设备在单细胞分析的广泛应用中发挥着至关重要的作用，其中流体动力学聚焦技术因结构简单且能良好适应多种流量条件而备受青睐。由于软光刻技术的广泛应用，聚二甲基硅氧烷（PDMS）被广泛用于微流控设备的制造。然而，在高通量条件下，PDMS的弹性变形会导致微通道扩张，从而削弱聚焦效果。为了解决这一难题，本研究提出了一种具有简化单层结构的三维流体动力学聚焦装置，该装置通过双转移工艺制造，专为聚氨酯丙烯酸酯（PUA）微流控设备的制备而设计。值得注意的是，这种工艺省去了耗时的加热步骤，与软光刻工艺相比，其制造速度提高了一个数量级。为了评估该微流控装置的实际聚焦性能，研究人员采用了光学时延显微镜技术对临床尿液样本进行了高通量成像分析。实验结果表明，随着流速的增加，垂直和横向方向的聚焦效率均逐渐提升。当平均流速为16.7米/秒时，垂直方向的聚焦效率达到98.4%，横向方向为95.0%。因此，该技术凭借其简单性、高效性和适应性，成为微流控领域中一种极具前景的工具，尤其适用于需要在高通量环境下实现精确细胞聚焦的应用场景。

流式细胞术凭借其强大的功能在单细胞分析中发挥着重要作用，包括细胞计数、检测和分选等。这些技术已广泛应用于临床诊断和学术研究领域。随着微流控技术的快速发展，其在便携性、成本效益和集成性方面具有显著优势的微流控细胞分析技术，受到了学术界和商业界的广泛关注。最近，人们在微流控平台上开发出了许多检测方法，包括侧向/背景散射技术。荧光测定法拉曼光谱，电气阻抗光声成像，以及光学成像同时，上述检测方法可与不同的主动分选技术相兼容，例如光镊技术。介电泳（DEP），表面声波（SAW）以及微电机械系统（MEMS）这进一步拓展了其在实际应用中的范围。为了实现更高的检测准确性和分选精度，流动聚焦技术在连续流体中微粒的分布过程中至关重要，它能够确保所有微粒稳定地通过检测/驱动窗口。更具体地说，连续流动的微粒受到各种物理力的作用，包括流体动力学力、惯性力、粘弹性力、疏水力、电场力和声场力，这些力能够快速而精确地将微粒聚焦到微通道内的预定位置。

其中，流体动力学聚焦技术利用鞘流将微粒限制在核心流中，该技术可应用于结构简单的微流控装置中，从而实现微粒大小和流速的精确调节。因此，流体动力学聚焦技术与多种检测和分选方法兼容，已被广泛用于微流控细胞计数领域。不过，对于二维流体动力学聚焦而言，样品仅能在水平方向上被聚焦，这限制了其在高精度应用中的潜力。例如，在典型的成像细胞计数系统中，当粒子偏离焦点平面时，许多细节信息就会丢失。为了解决这个问题，三维流体动力学聚焦技术还能在垂直方向上限制粒子运动，从而避免对单个粒子信号采集的影响。例如，Testa等人选用聚甲基丙烯酸甲酯作为基材，通过微铣削和热粘合工艺制造出三维微通道，其中鞘流通道的高度大于样品通道，从而实现粒子在水平和垂直方向的同步聚焦。同样，Sakuma等人利用湿法蚀刻和阳极键合技术制备了硅玻璃微流控芯片，其中水平鞘流和垂直鞘流与样品流有序连接，从而实现了三维流体动力学聚焦。不过，要实现片上三维流体动力学聚焦，仍需要多层微通道结构，而这会增加制造难度（即多步光刻和超精密对准过程），从而限制了其实际应用前景。

为了降低制造难度，单层结构策略受到了学术界的广泛关注。其中一种方法是通过复杂工艺制作模具，从而替代精确对齐和粘合的过程。例如，Eluru等人报道了一种具有突变通道深度变化的单层PDMS微流控装置，该装置能够实现流体动力学三维聚焦，其中样品入口和两对护套入口分别连接在一起，以控制样品沿预定路径流动。不过，在这种设计中，由三层SU-8光刻胶组成的复合模具需要在硅片上经过多步光刻工艺，这仅略微降低了制造难度。另一种方法则是利用弯曲通道产生迪恩流，从而实现颗粒在垂直方向上的聚焦。Nawaz等人设计并制造了“微流控漂移”装置，该装置利用一对核心入口和护套入口与弯曲通道相连，以控制颗粒在垂直方向上的流动，同时另有一对护套入口与弯曲通道相连，以实现水平聚焦。虽然这种方法可以实现亚微米级精度的三维聚焦，但由于对流速配置有严格要求（典型流速范围为50 μL/min至550 μL/min），因此其在大规模应用中的潜力受到限制。

此外，PDMS是一种常用于软光刻技术的材料，可用于制造具有复杂通道结构的微流控装置。由于PDMS具有弹性，因此在高流速（通常流速大于1米/秒）下，微通道壁会发生严重的膨胀变形，从而显著降低其聚焦效果。Yaxiaer等人指出，玻璃材料能够有效减少流速引起的通道壁变形，从而在高达25米/秒的超高速流速下仍能保持稳定的聚焦效果。不过，由于其复杂的制备过程且耗时较长，因此在实际应用中尤其是大规模应用方面受到限制。因此，开发一种结构简洁、制造快速的适用于高速3D流体动力聚焦的微流控装置，对于高通量微流控细胞分析技术而言具有重要意义。

在这项研究中，我们提出了一种采用单层结构的3D流体动力学聚焦微流控装置，该装置可通过双转移工艺快速制造。我们的设计通过将垂直和横向鞘流通道垂直集成到单层结构中，利用两种互补的流体动力学机制实现高效的3D限制：首先，对于垂直聚焦，我们采用了具有逐渐变窄通道的非对称T型接头。当样品流和垂直鞘流在变窄通道中交汇时，两种流体之间的惯性差异使得样品流被动地限制在通道横截面的上半部分。这种惯性辅助的垂直压缩方式无需多层高度差即可实现稳定的垂直聚焦。其次，对于横向聚焦，在垂直聚焦区域的下游设置了两个对称的横向鞘流通道，其中鞘流的速度高于样品流的速度。基于流体的粘性剪切力和压力梯度，鞘流对样品流施加向心挤压力，使其向通道的中心轴方向压缩。通过数值模拟验证了样品在垂直和水平方向上的流动限制增强效应。随后，我们建立了流体-结构耦合数值模型，比较了由PDMS和PUA材料制成的微流控装置的聚焦效果。与PDMS装置相比，由于严重的变形导致其聚焦效果下降，而PUA装置具有较好的抗变形能力，因此能在高速度下保持稳定的聚焦效果。利用PUA材料的光固化特性，我们开发出了双转移工艺，使得微流控装置能够在5分钟内快速制造出来。之后，我们使用红色墨水进行流体动力学聚焦可视化实验，以研究样品流的流动情况并评估不同流速配置下的3D流体动力学聚焦效果。最后，我们利用光时延显微镜对临床尿液样本进行成像，以评估微流控装置的聚焦性能。实验结果表明，随着流速的增加，垂直和横向方向的聚焦效率逐渐提高，当流速达到16.7米/秒时，分别达到了98.4%和95.0%。这充分证明了我们所提出的微流控装置的实用性和有效性，使其成为单细胞分析等高通量应用领域的理想工具。

为利用单层结构实现三维流体动力学聚焦，微流控装置设计了垂直和横向聚焦过程，如图1a所示。在垂直聚焦过程中，一对鞘液和样品入口被有序设置在逐渐变窄的通道上，从而形成非对称T型接头。当流动特性表现为高雷诺数（典型数值Re＞25）时，由于惯性作用，样品流会被鞘液流部分包围。如图1b中的流动可视化模拟结果所示，样品入口处及逐渐变窄通道末端处的浓度分布表明，在流体动力学惯性的作用下，样品流可被压缩至通道截面的上半部分。在横向聚焦过程中，两个鞘液入口被设置在狭窄通道的两侧，此时被压缩的样品流被两股鞘液流夹住。由于对称鞘液流的作用，样品流可在横向进一步被压缩。最终，三维流体动力学聚焦效果可在检测窗口观察到，如图1b中的插图所示。同时，为减少芯片材料对检测光束的吸收，在检测窗口处，微通道的上部被包裹在高透光率的玻璃材料中，这不仅减少了微流控装置的厚度，还缩短了光路长度。由于玻璃属于脆性材料，该设计还能避免高速流动对三维聚焦和光学检测造成的变形影响。

为了优化三维聚焦效果，我们利用有限元仿真软件（COMSOL Multiphysics 5.6）对流量配置及其对流动特性的影响进行了数值分析。如图1b所示，垂直聚焦和横向聚焦过程分别进行了建模，其中狭窄通道末端微通道的特征尺寸以及检测窗口的尺寸分别为145微米×50微米和100微米×50微米（宽度×高度）。为分析流量配置对垂直聚焦过程的影响，我们将样品流的流量Q_S保持在100微升/分钟不变，同时将垂直护套的流量Q_V从100微升/分钟增加到1毫升/分钟。如图1c所示，随着流量比Q_V/Q_S的增加，样品流的轮廓逐渐缩小，且高度方向的收缩幅度大于宽度方向。随后，为了解析横向护套对横向聚焦过程的影响，我们将样品流流量Q_S和垂直护套流量Q_V分别保持在100微升/分钟和300微升/分钟不变，然后对横向护套流量Q_L进行参数扫描，范围从100微升/分钟增加到1毫升/分钟。图1d显示了随着流量比Q_L/Q_S的增加，样品流的轮廓发生变化，其宽度和高度均同步减小。通过仿真结果表明，通过增加Q_V/Q_S和Q_L/Q_S两个流量比，可以进一步提升聚焦效果。

由于雷诺数(Re)是一个重要的无量纲参数，它反映了流动中惯性效应与粘性效应的相对重要性。Re可以通过以下公式计算：

\(\mathrm{Re}=2(w\timesh)/(w+h)V\rho /\mu\)

其中w和h分别表示微通道的宽度和高度，V为平均流速，ρ和μ分别代表密度和动力粘度。平均流速的计算公式为：

\({\rm{V}}={\rm{Q}}/({\rm{w}}\times{\rm{h}})=({{\rm{Q}}}_{{\rm{S}}}+{{\rm{Q}}}_{{\rm{V}}}+2\times{{\rm{Q}}}_{{\rm{L}}})/(w\times h)\)

其中Q表示微通道内的总流量。因此，我们进行了参数化研究，通过保持流量比QS:Q_V:Q_L = 1:3:3不变，同时将总流量Q从0.5毫升/分钟调整为5毫升/分钟，以此来清晰地分析_Re对聚焦流最终形态的影响。当Re从27.5增加到275.6时，样品流的宽度逐渐减小，而高度则基本保持不变。由此可见，随着总流量的增加，Re也随之增大，聚焦效果相应得到改善。

由于软光刻技术的普及，PDMS被广泛用于制造流体动力聚焦微流控装置。然而，当流体以高流速注入时，液体流动产生的高压会导致PDMS通道发生弹性变形，从而削弱其3D聚焦效果。为减轻弹性变形对微通道聚焦能力的影响，我们选择塑料PUA作为微流控装置的基底材料。

为了定量评估变形对聚焦效果的影响，我们建立了流体-结构耦合数值模型，比较了当Re为275.6时，PDMS和PUA装置中的聚焦情况。在模拟中，PDMS的杨氏模量、泊松比和密度分别设定为2 MPa、0.45和1000 kg/m³，而PUA的相应参数为320 MPa、0.3和1050 kg/m³ 。流量比保持恒定，即Q_S:Q_V:Q_L = 1:3:3。首先，我们比较了总流量为5 mL/min时PDMS和PUA装置的物理状态，此时Re为275.6。如图2a所示，PDMS装置出现了严重的变形，最大应变达到130.1 μm，因为PDMS微通道结构与玻璃紧密结合。而对于PUA装置，由于它由具有微通道的PUA材料和光滑基底组成，在相同流量条件下仅观察到微小变形，其应变小于90.1nm，如图2b所示。接下来，我们计算了总流量从1 mL/min增加到5 mL/min时应力和应变的变化情况，如图2c所示。由于在高通量条件下PDMS装置中微通道边界受压力驱动而膨胀，因此PDMS装置内的最大压力略低于PUA装置。不过，PDMS装置的变形程度仍然远大于PUA装置。

随后，我们利用应变信息重建微通道的几何结构，并分析变形对流场的影响。例如，图2d、e分别展示了考虑变形后PDMS和PUA装置的流场情况，其边界条件是根据图2a、b中的模型重新确定的。如图2d所示，由于通道的变形，在垂直鞘流的作用下，样品流的流线被挤压到通道顶部。当横向鞘流在通道出口处作用时，流线则分布在通道上部的两个角落。因此，在高流速条件下，流体压力导致的PDMS通道变形会使其失去横向聚焦能力。随着流速的增加，样品流剖面的变化如图2f所示。随着流速的增大，变形程度加剧，样品流逐渐从通道中心向上部侧角挤压。同时，样品流剖面的面积也逐渐增大，说明聚焦效果减弱。如图2e所示，由于PUA装置内的微小变形相对于通道的特征尺寸（125 µm × 50 µm）来说可以忽略不计，因此它几乎不对流场产生任何影响。因此，PUA装置能够在高速条件下保持稳定的聚焦效果，从而满足高通量应用的需求。

如图3a所示，基于PUA的微流控装置是通过双重转移工艺制备的。由于PUA（20–60 mJ/m²）的表面能高于PDMS（19–21 mJ/m²），液态PUA会迅速润湿PDMS表面。同时，PUA与PDMS之间的微弱粘附力使得光固化后的PUA块状结构能够轻易从PDMS表面剥离，从而实现图案的转移。因此，我们首先制造出用于生产微流控芯片基座的PDMS模具。将PDMS原料（Sylgard 184，道康宁公司提供）按1:10的重量比例混合后倒入定制的硅片上，该硅片上已涂有厚度为50 μm的SU-8光刻胶图案。将混合好的PDMS材料在80 °C下加热一小时后，即可从硅片上剥离下来。如图^3b所示，扫描电子显微镜图像显示，PDMS材料的表面非常光滑，且成功从SU-8模具上转移过来。接下来，通过在预定位置用直径为1毫米的冲头打孔，再插入直径为1毫米、高度为8毫米的PDMS圆柱体，从而形成微流控装置的进出口结构。为防止在注入PUA时液体溢出模具，我们在图案化的PDMS材料周围粘贴了光滑的PDMS壁。同时，为消除圆柱体与PDMS材料之间的缝隙，我们使用少量PDMS混合物填充模具中的缝隙，然后再次将整个模具在80 °C下加热30分钟进行固化处理。

然后，我们制造PUA装置。使用胶水分配器（YCL-983，益川龙科技有限公司）将0.5毫升的液态PUA（H807，京诚科技有限公司，中国生产）注入PDMS模具中。选择PUA材料时需考虑其折射率和透光率的匹配性。具体PUA型号的对比数据可见表S1及图S1。待材料自流平后，将厚度为130微米的标准盖玻片剪切成8×8毫米的大小，并将其安装在检测窗口处。接着，使用72瓦的紫外线光源（HC35，京诚科技有限公司，中国生产）对整个结构进行10秒的紫外线照射处理。待温度降至室温（超净实验室中的温度为25摄氏度）后，将PUA块从PDMS模具中剥离下来。为了制备PUA基底，先在标准载玻片上均匀滴加0.1毫升的液态PUA，然后再将表面光滑的PDMS块压在载玻片上，以确保PUA表面的平整度。经过10秒的紫外线光固化处理并冷却至室温后，再次将PDMS块从PUA基底上剥离下来。接下来，将PUA基底精确地对准基底放置，施加均匀的压力，然后进行15秒的紫外线照射处理。最后，如图3d所示，在流体进出口处分别安装五根不锈钢毛细管，并用树脂密封以防止泄漏。在所提出的工作流程中，由于PDMS模具可重复使用，单个微流控装置的制造时间可缩短至5分钟内。与软光刻技术相比，制造速度提高了一个数量级，这为大规模应用提供了高效且可行的解决方案。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41378-026-01212-5